内含子的表达

端粒*衰老*癌症

简介
端粒是真核染色体上特有的结构,由端粒DNA和端粒相关蛋白质组成。绝大多数真核生物的染色体为线状，端粒位于染色体的末端，是真核生物染色体的三个基本结构（复制起点，
着丝粒，端粒）之一，在染色体的复制和稳定性的维持中都有着极其重要的作用。
首先，端粒对染色体的末端起一个封闭的作用，可以防止染色体DNA的降解。而且，如果没有端粒，染色体的游离末端之间就可能会发生融合，形成双着丝粒染色体，或分叉染色体，造成染色体断裂，基因重组，基因丢失等异常。
早在1960年代，Hayflick等就已发现，体外培养的人类正常细胞存在一个最高分裂次数，称为Hayflick界限。后来人们证明了这一界限是由基因决定的（Harley
et
al.,1990,1992）。近期的很多实验表明决定细胞分裂潜力的分子机制和端粒有关。人类正常细胞的端粒随分裂次数的增加而不断削减，这一现象已被充分证实。在哺乳动物细胞中，端粒长度和细胞分裂潜力有着很强的一致性。基于此，有人提出了端粒是细胞的分子钟的假说（Harley,et
al.,1991，1992，1996）。
DNA损伤，在没有端粒酶的情况下连续分裂或端粒相关蛋白的改变都可能造成端粒功能的异常甚至端粒丢失。端粒的损伤或功能异常可能引起细胞衰老，死亡或突变。现已证实端粒的功能异常能够使有丝分裂中的细胞发生癌变（Blasco
et al.,1997;Chin et
al.,1999）。但同时必须有相应的机制恢复端粒的功能，否则癌细胞将无法生存（Kim
et
al.,1994）。另一方面，越来越多的证据表明端粒的功能异常会引起衰老，如免疫衰老等（Chang
and
Harley,1995）。这里似乎存在着一个矛盾，但相关的研究正在使这一矛盾趋于调和。

端粒的组成和结构 端粒DNA
所有脊椎动物的端粒都包含数百至数千个重复的简单序列：5’-TTAGGG-3’。端粒DNA的大部分区段为双链DNA，但每个端粒的末端都有一小段3’端突出的单链DNA。这一段突出的DNA是端粒酶的底物，细胞中的逆转录酶能够把端粒DNA加到染色体的末端。端粒的结构尚不清楚，但它应当能够防止3’突出端的降解和被聚合酶不正常的延伸（Wellinger
and Sen,1997）。
TTAGGG重复区段的长度（胚系细胞）大体上随物种的不同而不同（Greider,1996）。人类的端粒为10-15
kb，而实验小鼠（Mus
musculus）的端粒要长得多（>30kb）而且更具异质性。另一方面，另一种小鼠（Mus
spretus）的端粒却比人类的稍短。在同一物种的不同体细胞中，端粒的长度也有不同。因此，遗传型，细胞型和细胞的分裂历史都是影响端粒长度的重要因素（Chang
and Harley,1995）。
端粒的全长对端粒的功能有什么重要意义呢？不同物种间的比较提示，当端粒的长度在某一未知的下限以上时，端粒的长度对细胞的表型几乎没有影响。人类（Homo
sapiens）和Mus
spretus有相似的端粒长度，但寿命和癌症的发生率都很不相同。相比之下，许多实验小鼠品系的端粒比野生小鼠品系的端粒长得多，但它们却有着相似的生命历程。正如下面我们将谈到的，端粒的功能似乎更多地依赖于端粒的结构而不是端粒的长度。不过，细胞内外许多事件都会影响到端粒功能的保持，包括端粒的长度小于前面提及的下限。
端粒相关的蛋白有数种哺乳动物的端粒相关蛋白已被鉴定出来。它们中大部分的功能是调节端粒的长度和功能。其中有些蛋白只和端粒有关，而另一些则定位于亚细胞核或亚细胞位点。当然，对端粒相关蛋白详尽的描述将超出本文的范围。在此，我们只能作一些简单的介绍。
在哺乳动物中，两个蛋白TRF1和TRF2特异地与双链的端粒DNA结合，POT1则特异地与3’端突出的单链结合。TRF2
和POT1对稳定端粒的结构和防止染色体末端降解和融合有重要的作用。一些以前知道的参与DNA修复的蛋白最近在端粒中被重新发现。它们在端粒的维持中起到重要的作用。
端粒酶在大多数真核细胞中，端粒DNA的补充需要端粒酶。端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白体（Greider,1996）。在一些细胞中，导入端粒酶的活性能够延长端粒和细胞的生命。在90%以上的肿瘤细胞中观察到了端粒酶的活性（Shay
and
Bacchetti,1997）,这表明肿瘤细胞利用端粒酶保持端粒并进而保持增殖能力。hTERT基因编码人类端粒的催化单位，该基因的导入可是很多类型的细胞永生化，但在另一些细胞类型中却得到非常不同的结果（Rufer
et
al.,2001）。由此可见，端粒酶在端粒的维持中的重要性，但同时，端粒酶对整个细胞命运的影响则复杂的多。端粒的结构
最近，人们发现端粒的末端呈一个环状的套索结构，称为t-环（t-loop）。从已分离的人类，小鼠和原生动物的t-loop看，它应是一个进化上的保守结构（Griffith
et
al.,1999）。在人类和小鼠中，t-loop的大小和端粒的长度一致。从人类正常淋巴细胞的约3kb到小鼠肝细胞的18kb。而在原生动物中，尽管端粒长达10-20kb，但t-loop只有约1kb。这些发现提示t-loop的大小是可以调节的。而且，t-loop应当能够在相对短的端粒上形成。当然，还应假设有一个下限，端粒长度低于此下限则t-loop不能形成。t-loop的形成和稳定还涉及到前面提及的几种端粒相关蛋白。间接的证据表明，3’端突出的单链端粒DNA埋在双链DNA中形成t-loop，进而防止染色体末端的降解。

端粒的损伤对细胞的影响
端粒的状态对细胞的表型和命运有着复杂的影响。一般说来，细胞会试图修复受损的端粒，尤其当它能够表达端粒酶时。然而，大多数的细胞并不表达端粒酶（Shay
and
Wright,2001）。端粒的损伤使它们停止增殖，走向衰老。这一过程涉及到细胞周期和DNA损伤的检验点，需要抑癌基因p53和RB的参与。如果RB失活，只有p53有活性，则细胞会走向死亡。如果p53和RB都失活，细胞可能将继续生存下去，但会伴有基因组不稳定。也就是说，端粒损伤可能会造成细胞衰老，死亡或基因组不稳定三种不同的结果，这要依细胞的具体情况而定。
细胞衰老与胚系细胞和早期胚胎细胞不同，大多数哺乳动物细胞并不表达端粒酶。这显示了在细胞分裂中存在着一个问题。因为DNA的复制是双向的，而DNA聚合酶的催化方向只有一个，并且需要一段短而不稳定的RNA作为引物。在细胞周期的S期末，总有50-200bp的3;端端粒DNA保持未复制的状态。这样，在没有端粒酶的情况下，细胞每分裂一次，端粒就削减一些。当端粒削减到一定程度，正常细胞将不可逆地停止增殖，并伴有一系列复杂的形态和功能上的变化。这一现象称为细胞衰老（Cell
Senescence）。有些成年个体的体细胞能表达端粒酶，虽然这种现象并不多见
。例如，在激活的人T细胞中，端粒酶有瞬时的表达;一些干细胞也呈端粒酶阳性。尽管激活的T细胞中有端粒酶的活性，但酶一次分裂仍会引起端粒的削减，并最终走向衰老（Effros,1998）。看来，端粒酶并不足以阻止分裂中的端粒削减和细胞衰老。另一方面，在某些人类细胞例如，成纤维细胞，视网膜上皮细胞或内皮细胞中导入端粒酶，可以阻止端粒削减和衰老（Bodnar
et al.,1998）。
在抑癌基因参与下的衰老可以看作是细胞的一种自我保护机制，防止细胞在染色体不稳定的情况下继续分裂而引起癌变。与此一致的是，当细胞遭遇DNA损伤或癌基因突变时也会发生同样的衰老现象。在成纤维细胞中，当RAS突变时，即使引入端粒酶也不能阻止细胞的衰老（Wei
et
al.,1999）。因此端粒损伤所引起的衰老可能并不是一种针对于端粒特有的现象，而应当是一种针对于可能引起基因组不稳定的刺激的普遍现象。
细胞死亡
p53和RB调节使细胞停止增殖或凋亡的途径。任何一条途径中的成分发生了突变都会影响细胞对端粒削减的衰老反应，也同样影响对其它刺激的衰老反应，这在肿瘤细胞中是很常见的（Zhang
et
al.,1999）。如果RB失活而p53有活性，端粒功能异常的细胞将更倾向于死亡。例如，引入TRF2显性负的突变能够使肿瘤细胞发生p53依赖的死亡（Karlseder
et al.,1999）。
P53和RB都失活，大多数细胞会继续增殖直到端粒变得极短，这时细胞进入了一个称为危机点的不稳定状态（Wright
and
Shay,1996）。在危机点细胞试图分裂，但严重的端粒损伤和染色体不稳定使大多数细胞死亡。只有极少数的细胞通过突变等方式稳定了自己的端粒而继续增殖下去（Kim
et al.,1994）。它们发生恶性转化的可能性很大。
基因组的不稳定性缺乏端粒保护的染色体非常不稳定，易于降解，重组和融合。如果这样的细胞p53和RB失活，它们将在这种不稳定的状态下生存。基因组不稳定的细胞要生存下去就必须稳定它们的端粒，而基因组不稳定大大增加了突变的频率，这使得细胞可以通过突变重新获得端粒的稳定。这一过程大多是通过表达端粒酶实现的（Kim
et
al.,1994）。在正常的衰老途径失活的情况下的基因组不稳定可以看作是癌变形成“多击途径”中的一击。

端粒和癌症
在一些细胞系中得到的证据表明，端粒和恶性肿瘤发生发展中的几个途径有关。前所述及，端粒的功能异常，不论是由于分裂引起的削减，直接损伤或者是相关蛋白缺失，都会给细胞带来三种不同的命运：衰老，死亡或基因组不稳定。其中，基因组不稳定明显预示着可能发生恶性转化。而细胞的衰老和死亡则可以看作是抑癌基因对转化的预防。
许多细胞对端粒功能异常最初的防护可能是衰老反应。衰老阻止了细胞增殖也就阻止了转化。然而，体细胞中的一些突变会使衰老途径失活。如果这时p53有活性，细胞还可启用第二道防线，即细胞死亡。如果p53或p53途径中的其他成分失活，细胞发生转化的可能性就会非常大。
小鼠在端粒酶缺失的情况下端粒会逐渐削减。但由于它的端粒特别长，因此要经过4-6代后才和典型的人类细胞端粒长度相当。这时的小鼠患癌的机会大大增加，尤其是环境中有致癌因素时（Lee
et
al,1998）。类似的现象在人类中也有，先天性角化不良是由于端粒酶RNA组分的加工缺陷造成的，患者有很大的患癌倾向。同时，晚代小鼠和人类先天角化不良患者还罹患一些和衰老有关的疾病，如免疫衰老，白发脱发等。端粒酶一方面能够维持端粒的正常功能，有着稳定基因组防止癌变的作用。另一方面，癌细胞需要端粒酶维持端粒的稳定，端粒酶又有着促癌的作用。端粒酶对癌变发生的作用受到细胞内外许多因素的影响，因此，简单地说端粒酶更倾向于促癌还是抑癌是不科学的。

端粒和衰老
前所述及，衰老不仅仅是生长不可逆的停滞，而且涉及到许多功能的改变。衰老细胞分泌的细胞因子可能会引起组织功能和统一性的下降。这是端粒功能异常通过细胞衰老造成的影响（Campisi,2000）。
细胞的衰老可以防止癌变，但同时又会引起机体衰老。这样，随着年龄的增长，衰老细胞越来越多，对机体的负面影响也就越来越大。衰老细胞分泌的一些因子破坏了组织的微环境，使癌变易于发生。而突变率也随着年龄的增加而增加。这些都应是造成癌症的发生率随年龄增长的原因。如此，端粒功能异常引起的衰老在年轻的个体中倾向于防止癌变而在年老的个体中则变成倾向于促进癌变了。